Quantification of bacterial populations in complex ecosystems using fluorescent in situ hybridization, confocal laser scanning microscopy and image analysis

Abstract

A procedure for quantification of distinct bacterial populations in aggre-gated ecosystems was developed. It is based on fluorescent in situ hybridization coupled with confocal-laser-scanning microscopy and surface measurement of hybridized bacteria by image analysis. The proportion of a targeted bacterial species was ob-tained by comparison between the surface hybridized by a specific probe and the surface hybridized with a general bacterial reference probe. The accuracy of the re-sults obtained was evaluated by direct visual counting on the same sets of images. The analytical uncertainty of the image analysis procedure was determined and de-pended on the threshold values selected by the operator for cutting between signal and background fluorescence. The number of fields to be analyzed for reliable quantification was also determined. This procedure allows a quantification of the proportions of bacterial species in aggregated bacterial ecosystems which gives more accurate re-sults than visual counting because of the large number of bacteria counted. Moreover, since floc structures are preserved, it also gives information about the distribution of bacterial populations in the floc material which might reveal bacterial interactions within the community.

Résumé

Une procédure de quantification de populations bactériennes agrégées a été développée. Elle repose sur l’analyse d’images obtenues a l’aide d’un microscope laser confocal après hybridation in situ en fluorescence. La proportion d’une espèce bactérienne cible est obtenue par comparaison entre la sur-face hybridée par une sonde nucléique spécifique et la surface hybridée par une sonde générale bactérienne de référence sur une série d’images données. L’exactitude des résultats obtenus a été évaluée par comptage manuel sur les même séries d’images. L’incertitude de la procédure d’analyse d’image dépend de la taille de l’intervalle choisi par l’opérateur comme étant représentatif des seuils de niveau de gris entre signal positif et bruit de fond. Il est également possible de déterminer le nombre de champs nécessaire a prendre en compte pour obtenir une quantification valable. La procédure développée permet de quantifier les proportions des espèces bactéri-ennes présentes dans un écosystème agrégé (flocs, biofilms...). Étant donné qu’un grand nombre de bactéries est pris en compte, les résultats obtenus sont plus précis que ceux obtenus par comptage manuel. De plus, les structures bactériennes étant préservées, il est possible d’obtenir des informations concernant la répartition des espèces au sein du floc. La nature de cette répartition peut nous aider a comprendre les interactions bactériennes au sein du floc.