Composition of human intestinal flora analysed by fluorescent in situ hybridisation using group-specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes

Abstract

Cultivation methods classically used to describe the faecal flora composition are often too selective for certain groups of bacteria. This study was conducted to determine the human faecal flora composition by fluorescent in situ hybridisation, a direct and culture-independent method. Four group-specific probes and a domain probe Eub 338 targeting the 16S rRNA were used to analyse fixed faecal bacterial suspensions from nine healthy adult volunteers. Epifluorescence microscopy and image analysis were performed to evaluate the relative proportion of cells from each group. After optimisation of hybridisation conditions, the reproducibility of the protocol was evaluated to validate the FISH procedure. The domain probe Eub 338 labelled an average of 80 ± 11% total faecal bacteria. The panel of four probes revealed more than 75% of the flora. The Clostridium coccoides-Eubacterium rectale group was the most represented, accounting for 36 ± 7% of the bacteria. The three other probes used, Bacto 1080, Bif 164 and Fprau 645 labelled 17 ± 5%, 15 ± 9% and 23 ± 5% of the total flora, respectively. The two dominant groups belonging to Clostridium and relatives constituted nearly 60% of the total flora. FISH coupled with image analysis is a direct and powerful molecular tool to assess the composition of the human faecal flora.

Résumé

Les méthodes de culture classiquement utilisées pour étudier la composition bactérienne au sein de la flore fécale de l’homme sont souvent inadaptées car trop sélectives. Cette étude a pour but d’analyser la composition de la flore intestinale par une méthode moléculaire utilisant des sondes oligonucléotidiques fluorescentes ciblant les ARNr 16S. Une sonde de domaine Eub 338 ainsi qu’un ensemble de quatre sondes ciblant des groupes dominants de cet écosystème ont été utilisés. Les sondes spécifiques marquent les groupes phylogénétiques suivants: Bacteroides-Porphyromonas-Prevotella, Clostridium coccoides-Eubacterium rectale, Fusobacterium prausnitzii et apparentés ainsi que le genre Bifidobacterium. Elles ont hybride sélectivement avec leurs bactéries cibles préalablement fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % puis rendues perméables par incubation en présence de lysozyme à 1 mg/mL. Le marquage des sondes par le Cy3 a permis une visualisation des bactéries en microscopie en épi-fluorescence. Après optimisation des conditions d’hybridation, la reproductibilité de la méthode a été évaluée sur des échantillons de selles afin de valider l’ensemble de la procédure. Dans toutes les suspensions fécales, 80 ± 11 % des cellules présentes ont été hybridées avec la sonde de domaine Eub 338. L’additivité obtenue avec l’ensemble des quatre sondes de groupe a toujours été supérieure à 75 % pour les neuf individus étudiés. Le groupe Clostridium coccoides-Eubacterium rectale était le plus important puisqu’il représentait en moyenne 36 % des cellules bactériennes de la microflore intestinale. Les trois autres sondes, Bactol080, Bif 164 et Fprau 645 ont marqué respectivement 17 ± 5 %, 15 ± 9 % and 23 ± 5 % de la flore fécale. Les deux groupes dominants mis en évidence par les sondes Erec 482 et Fprau 645 regroupaient à eux seuls près de 60 % de la totalité des bactéries présentes. De plus, la sonde Fprau 645 a permis de mettre en évidence des cellules présentant une morphologie particulière. L’hybridation in situ couplée à l’analyse d’images avec un ensemble de quatre sondes ciblant les groupes dominants de la microflore fécale de l’homme est une méthode d’étude directe et puissante. Elle permet le classement des bactéries en grands groupes ainsi que la description de leurs morphologies. L’utilisation de sondes de spécificité plus restreinte permettra une identification plus fine au niveau de l’espèce et rendra possible la mise en évidence des populations moins représentées.